最新专利CRISPR脱靶检测抗除草剂藜 [复制链接]

透过专利信息跟踪农业生物技术

最新研究成果——年第22周篇

作者：莱肯生物

很多技术和产品的创新由于各种原因无法或暂时无法发表研究论文（高影响因子论文和高价值专利评判标准的不同、保持新颖性的需要、保密技术细节的需要等），因此公开的专利信息就是跟踪最新技术和产品的重要渠道。

然而，中国的专利年申请量已接近万件，如何从浩如烟海的专利资料中找寻到有价值的信息是一项具有挑战的工作。

本专栏将定期梳理最新公开的农业生物技术领域的发明专利，并就部分专利进行简单介绍，以为相关从业者提供有价值的信息参考。

今天让我们看看年第22周都公开了哪些农业生物技术相关的专利。

年第22周公开的

部分农业生物技术专利简介

关键词：CRISPR脱靶检测、抗除草剂藜麦、黑暗诱导型启动子、玉米单倍体诱导基因

1、基因编辑

华南农业大学申请的专利10069861X（发明人：徐泽凌;陈淑珍;刘志晴;徐梓锐;张炼辉）公开了一种基因表达调控系统及其应用。本发明提供的I?F型CRISPR?Cas双质粒系统能够准确识别并结合靶标基因的启动子区域，通过常规质粒转化即可实现对靶标基因转录表达的有效抑制。该系统在细菌基因功能研究中具有明显的简便性，同时在细菌生理学研究、代谢通路改造、天然化合物合成、药物靶点发现、新型药物开发、高通量筛选等方面都具有广阔的应用前景。

上海达澈生物科技有限公司申请的专利101019495（发明人：许志敏;*梅;许世冲;王春晓）涉及一种检测CRISPR基因编辑脱靶的方法，包括细胞交联、抗体固定、超声处理、染色质免疫共沉淀、DNA纯化、DNA处理、文库扩增七个步骤。本发明在多个步骤共同作用下，通过对CRISPR/Cas9基因编辑过程中Cas9蛋白和靶位点和细胞自身修复蛋白H2AX、MRE11与靶位点形成的蛋白?核酸复合体进行免疫共沉降，并结合测序及其他必要技术手段，实现对脱靶位点的筛选，极大地简化了识别脱靶效应的过程，同时也提高了结果的准确性，能为更好预测基因组编辑如何在临床环境中发挥作用起到有力技术支撑。克服了现有技术限制，存在检测周期较长，灵敏度低的缺点，以及检测过程时间较长，步骤繁琐，且不能保证所有断裂位点都被标记的弊端。

2、抗虫抗除草剂

安庆市长三角未来产业研究院和浙江大学申请的专利102733961（发明人：喻景权;吴少芳;胡璋健;吴鑫怡;胡超轶;李佳佳）公开了PUB22基因在调控植物对虫害胁迫抗性中的应用。本发明首次公开番茄PUB22基因在调控植物对虫害胁迫尤其是棉铃虫抗性方面的用途，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术缺失PUB22基因功能，可显著减弱植物对棉铃虫的抗性，证明了PUB22基因在提高植物虫害胁迫抗性中的用途，可将其应用到抗虫害胁迫植株品种的培育中。

中国科学院微生物研究所申请的专利9（发明人：张莉莉;宋直钰;霍岩）公开了GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病*的分子靶标的应用。LsGrpE蛋白来源于灰飞虱（Laodelphaxstriatellus），LsGrpE可以用作抗灰飞虱的分子靶标用于灰飞虱的防治，并且可以间接阻止RSV的垂直传播过程。

贵州大学申请的专利102447495（发明人：杨洪;曾庆会;王召;杨熙彬;龙贵云）公开了一种Dicer1基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。本发明通过白背飞虱基因组和转录组数据库和软件比对分析，获得类似白背飞虱Dicer酶1（SfDicer1）序列。基于序列合成目的基因的dsRNA，通过显微注射法将dsRNA摄入白背飞虱体内，发现可以特异性沉默靶标基因，影响白背飞虱正常的变态发育。本发明可用于以白背飞虱RNA干扰介导的害虫防治，同时也可用于新型杀虫剂靶标基因的研发。

山西农谷稼祺种业有限公司申请的专利102064642（发明人：武祥云;丁鹏程;贺培洋;李芸;郝志峰;陈金良;武安邦;樊翠云）涉及一种藜麦CqALS基因突变体及分子鉴定方法和应用。藜麦CqALS?5突变体为CqALS2?1基因第位的G突变为T，导致产生对ASL类除草剂的抗性。

3、玉米

孟山都技术有限公司申请的专利100972949（发明人：T·J·巴滕;A·N·布朗;E·J·卡吉尔;R·福奎特;J·R·戈梅兹;M·S·马伦戈;M·欧耶维德斯加西亚;J·M·皮维斯;D·H·杨）涉及用于产生短枝（矮秆）玉米植物的方法和组合物。本发明提供了与玉米短枝性状相关联的标记，以及使用标记辅助选择培育具有短枝性状的玉米植物的方法。

华中农业大学申请的专利102113691（发明人：严建兵;姜程淋;李响）涉及一种与玉米单倍体诱导有关的基因。本发明通过将野生型与单倍体诱导系材料的多组学数据进行整合分析，从个过氧化物酶基因中，逐步筛选到在配子体发育时期分子层面存在差异，会影响ROS含量，进而可能导致单倍体诱导的3个功能基因，并进一步验证了这3个基因的单倍体诱导功能。

东北农业大学申请的专利102592569（发明人：周羽;王振华;卢晴;邸宏;张林;李益晨;董玲;祖洪月;曾兴;刘显君）涉及ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用。本发明对RBSDV侵染的玉米进行了病原与寄主互作关系、抗性鉴定、和时空表达模式分析，发现了一种和与玉米抗粗缩病相关的蛋白ZmHIR3。在植物材料中过表达ZmHIR3蛋白的编码基因可以有效提高玉米材料的抗粗缩病能力。

中国农业大学申请的专利103001424（发明人：金危危;王天依;李云飞;*伟;王喜庆）涉及ZmAAP6蛋白在调控玉米胚乳蛋白质和淀粉含量中的应用。实验证明，在玉米中过表达ZmAAP6基因，会增加胚乳中蛋白质含量降低淀粉含量。抑制ZmAAP6基因后会得到相反的结果。

中国农业科学院生物技术研究所和华南农业大学申请的专利236709（发明人：王海洋;王宝宝;郑智刚;卓楚云;孔德鑫;徐妙云;谢钰容）公开了调控玉米根系夹角和倒伏抗性的基因ZmYUC2和ZmYUC4及其应用。本发明所提供的调控玉米气生根角度和倒伏抗性的基因能够特异的调控根尖局部的生长素合成，进而调控玉米根系的夹角，对其余农艺性状不造成不利影响，进而可应用于玉米根系角度和抗倒伏育种。

4、启动子

南京农业大学申请的专利102432108（发明人：管荣展;万书贝;杨茂;倪飞）涉及闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用。

本发明首次提供了基因BnaC03.FBA在油菜闭花授粉性状形成中的应用。本发明中启动子PFBA、闭花授粉性状控制基因BnaC03.FBA、其编码产物BnaC03.FBA蛋白、含有基因BnaC03.FBA片段的表达载体可以用于生产具有闭花授粉性状的转基因植物，以获得新的种质资源。

中国农业科学院油料作物研究所申请的专利X（发明人：刘*;匡琛;孙兴超;华玮;朱晓义）公开了一种植物维管特异性启动子pDAOFU及其应用。本发明从甘蓝型油菜明星品种ZS11中克隆DAOFU基因的启动子，构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体DX?pDAOFU，用农杆菌介导的方法进行植物转化，得到转基因拟南芥和油菜植株，对获得的转基因植株进行组织化学检测，Gus基因在维管组织有优势表达，而在逆境诱导处理后具有在维管组织中更强烈的诱导表达活性，该启动子能够驱动外源基因在植物维管中表达，尤其在干旱、高温、高光照等诱导条件下驱动外源基因在植物维管中表达更为显著，因此可利用该启动子提高和改进油菜等油料作物生长特性，从而培育出理想的耐干旱耐高温耐高光照油菜新品种。

浙江大学杭州国际科创中心申请的专利101341277（发明人：都浩;葛洁瑜;李泽琦）公开了一种植物诱导型启动子及其应用。该启动子为黑暗诱导型和/或绿光诱导型启动子。本发明首次从油菜中鉴定获得所述启动子元件，进一步对所述启动子进行改造，其黑暗和绿光照射下对下游报告基因的诱导性在显著增强。本发明利用所述启动子构建生物自发光系统模块，成功诱导植物在夜间发光，为发光植物白天积累能量晚上释放光芒，进一步提高植物的发光强度提供有用的启动元件。

湖南农业大学申请的专利101581302（发明人：周海燕;雍婕）公开一种具有分子内伴侣特性的序列，由一段信号肽（N）序列及一段UTR序列（I）组成，将其连接到目的蛋白基因序列上游与启动子中间，转化表达后催化底物，可显著提高酶催化效率。该片段在大肠杆菌中，不仅显著提高催化效率，且不区分组成型表达体系及诱导型表达体系，而信号肽区域和此UTR区域单独存在时，均无明显催化效率。本发明为其它蛋白表达及酶催化提供了介导显著提高酶催化效率的基因元件，可应用于大肠体系的酶表达及催化探索。

5、其他

普渡研究基金会申请的专利7（发明人：J·马;B·任;J·段;X·王）涉及根瘤菌tRNA衍生的小RNA及其调控植物结瘤的用途。

根瘤菌感染是在豆科植物中引发共生固氮根瘤的关键过程，这需要对细菌及其宿主产生的信号分子进行特异性识别。在这里，可以确定的是，根瘤菌tRNA衍生的小RNA片段（tRF）是调控宿主结瘤的关键信号分子，所述宿主结瘤揭示了细菌小RNA介导的原核生物?真核生物相互作用机制。本发明还提供了表达编码根瘤菌衍生tRNA的构建体的转基因植物，所述根瘤菌衍生tRNA随后被切割以产生人工tRF。本发明还提供了构建体及其生成方法，以及用于抑制植物中存在的结瘤负调控机制的修饰。

中国科学院西北高原生物研究所申请的专利102325873（发明人：刘宝龙;宗渊;樊光辉;包雪梅;李云;曹东）涉及调控玉米*质棕榈酸酯生物合成的关键基因及其用途。

LbPYP1基因具有酰基转移酶功能性，可促进类胡萝卜素的合成，具体可以调控枸杞中的玉米*质棕榈酸化，转化为玉米*质二棕榈酸酯（枸杞红素），还可以在烟草中表达，生成野生型烟草中不含有的类胡萝卜素化合物——玉米*质单棕榈酸酯，并大幅度提高烟草叶片总类胡萝卜素含量。本发明LbPYP1基因可以用于制备类胡萝卜素含量高、保健价值高的转基因植物品种。

中国农业科学院农业基因组研究所申请的专利102782898（发明人：马永硕;尚轶;*三文;仲阳）涉及西瓜苦味物质葫芦素E的转运蛋白及其应用。本申请在西瓜基因组中鉴定出一种能够运输苦味物质葫芦素E的转运蛋白，为西瓜分子辅助育种提供了理论依据，同时也为利用合成生物学技术合成葫芦素E提供了支持。

中国科学院植物研究所申请的专利102964326（发明人：舒庆艳;刘*安;李旸）公开了花斑形成与着色的关键糖基转移酶及其编码基因与应用。本发明所提供的糖基转移酶PhUGT78A22，能精确地催化糖基化花青素在斑或非斑的转化，从而导致‘和谐’中花瓣斑和非斑花青苷的差异。本发明为花青苷生物合成和积累的分子调控提供了一个新的视角，为提高观赏价值的花色育种提供新的思路，同时也为深入了解花青苷生物合成和积累的分子调控机制提供参考。

内蒙古农业大学申请的专利102169362（发明人：张笑宇;冯亚艳;张冬梅;霍宏丽;李乐乐;李得宙）提供一种马铃薯诱导抗病基因StZFP2，其为锌指蛋白基因，所述基因受硅酸钠诱导。施加硅酸钠的马铃薯幼苗，锌指蛋白基因StZFP2显著上调表达，将该基因克隆并转入马铃薯脱*组培苗中，接种马铃薯黑痣病病原菌（Rhizcotoniasolani），过表达锌指蛋白基因StZFP2的植株抗病能力明显增强，清除活性氧的能力也优于野生型马铃薯，表明本发明提供的锌指蛋白基因StZFP2能提高马铃薯对黑痣病菌的抗性。

天津德瑞特种业有限公司申请的专利3（发明人：张桂华;董海涛;冯婷;张文珠;庞金安）公开了一种与*瓜抗靶斑病相关的SNP标记及其应用。本发明公开的与*瓜抗靶斑病相关的SNP标记为对应于*瓜基因组中序列表中序列4的第54位所示的核苷酸，其为A或G。本发明的SNP标记与*瓜靶斑病抗性有关，分子标记鉴定结果与田间抗病表型一致性可达到93.33%，说明上述SNP标记可以用于检测*瓜抗靶斑病抗性，并进一步可用于*瓜分子标记辅助育种。

陕西科技大学申请的专利103258861（发明人：刘开辉;刘婉婷;丁小维;陈妮）提供一种极端嗜盐曲霉Hog1基因及其在提高植物耐盐性中的应用。本发明将极端嗜盐曲霉Hog1基因转入植物，经模拟盐胁迫试验表明，转基因植物在盐度胁迫下生长状态、生物量、种子重量方面明显优于野生型植物，耐盐性显著增强，表明本发明提供的Hog1基因在提高植物耐盐碱方面的具有重要应用价值。

青岛尚德生物技术有限公司和青岛红樱桃生物技术有限公司申请的专利102374032（发明人：肖志壮;方安然）提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR2及其编码基因和应用。本发明使用易错PCR方法对Bacilluslicheniformis来源的蛋白酶基因进行突变，再通过高通量筛选，获得蛋白酶突变体BLAPR2，相比于未突变的蛋白酶，本发明得到的蛋白酶突变体的热稳定性得到显著提高。

结案专利详察

“新颖的磺酰胺类化合物及其作为内皮素受体拮抗剂的应用”发明专利权无效宣告请求案被国家知识产权局评为年度专利复审无效十大案件之一。该案对化学医药领域发明专利审查具有很大的示范作用，同时也涉及了马库什权利要求的性质和技术方案优先权的认定、表格内容的充分公开认定、补充实验数据和引入区别特征动机对创造性的影响等一系列法律要点，可以给我们带来很多启发。因此，今天就让我们详细看看这个案件。

1、案件背景

年，南京正大天晴制药有限公司向专利复审委员会就埃科特莱茵药品有限公司所有的专利《新颖的磺酰胺类化合物及其作为内皮素受体拮抗剂的应用.3》提出专利权无效宣告请求。该专利于年12月4日申请，优先权日为年12月18日，年11月12日授权。

肺动脉高压是一种恶性心血管疾病，被称为“心血管疾病中的癌症”，因其发病率大约是七十五万分之一，年被纳入我国首批罕见病目录。“马昔腾坦”是埃科特莱茵研发的以内皮素受体为靶标的拮抗剂，通过有效阻断内皮素与受体的结合，有效延缓肺动脉高压的进程。该药成为首个获批用于治疗肺动脉高压的口服制剂。南京正大天晴在提交仿制药申请后，针对第ZL.3号原研药化合物专利发起了专利挑战。最终，国家知识产权局经审理后于年2月10日作出审查决定，在专利权人提交的修改文本基础上维持涉案专利权有效。

2、发明内容

该案授权公告的权利要求包括通式和一系列具体化合物，专利权无效宣告请求程序中经删除，仅保留化合物和马昔腾坦，二者的区别仅在于氨基磺酰胺基上的烷基链，化合物为乙基而马昔腾坦为丙基（见图1）。

图片来自：中国知识产权报，国家知识产权局专利局复审和无效审理部任晓兰

3、审查决定

（1）关于化合物优先权是否成立

专利法第29条规定，“申请人自发明或者实用新型在外国第一次提出专利申请之日起十二个月内，或者自外观设计在外国第一次提出专利申请之日起六个月内，又在中国就相同主题提出专利申请的，依照该外国同中国签订的协议或者共同参加的国际条约，或者依照相互承认优先权的原则，可以享有优先权。”

“相同主题的发明创造”是指技术领域相同、所解决的技术问题相同、技术方案和预期的技术效果相同的发明创造。专利法第29条语境下的“技术方案是否相同”，是指在后申请的技术方案作为一个整体，完整地记载在在先申请中。当在先申请涉及马库什化合物，在后申请为该马库什化合物范围内的一具体化合物时，如果在先申请未记载该具体化合物，本领域技术人员基于在先申请的整体内容亦不能确定该具体化合物被隐含记载在在先申请中，则该具体化合物权利要求不能享有在先申请的优先权。

本案中，请求人认为，本专利的优先权文件公开了与本专利相同的通式I化合物，记载了14个制备例，并给出了其中11个具体化合物，但未记载化合物和马昔腾坦，未记载化合物的实验数据和本专利所描述的技术问题，因此本专利不能要求在先申请的优先权。专利权人认为，化合物和马昔腾坦落入了化合物通式范围内，属于优先权文件中明确记载的马库什通式化合物内的具体化合物，因此应当享有优先权。

合议组认为：

首先，在先申请的马库什化合物与在后申请的具体化合物因不属于相同的技术方案而不被认为是“相同主题的发明创造”。根据专利审查指南第二部分第十章5.1节的规定，“通式不能破坏该通式中一个具体化合物的新颖性”，这意味着，如果在先申请系马库什化合物，在后申请系其范围内的一个具体化合物，则二者不能被认为属于相同的技术方案，因此也不可能构成相同主题的发明创造。

其次，如果基于在后申请的具体化合物落入在先申请的马库什化合物范围而认为在后申请可以享有在先申请的优先权，将违背优先权制度的本质要求。优先权制度的目的是为了方便成员国国民就其发明创造在其本国提出专利申请后，在其他成员国申请获得专利权。基于这一目的，专利法第29条规定，先后申请只有属于相同主题的发明创造才能享有优先权，否则将会损害其他申请人和公众的利益。马库什化合物作为一种特殊的化合物表达形式，通常被认为是由各取代基及不同的选择项形成的一个有机整体。通过总结结构共性而将申请人类似结构的化合物发明以马库什化合物的形式提交专利申请是化学领域发明专利审查实践中常见的，也是法律上不禁止的，但是，当在先申请撰写成马库什化合物时，如果认为在其范围内的任何一个具体化合物均可以因此而享有在先申请的优先权的话，则意味着在先申请将成为一个源源不断的“蓄水池”，申请人可以随意地把优先权日后在该马库什通式范围内的进一步研究所得到的新的具体化合物或者较小的通式化合物都贴上“优先权日”的标签，这显然违背优先权制度的初衷。

因此，判断在后申请的具体化合物或者小通式化合物是否能够享有在先申请的优先权，应当以该具体化合物或者小通式化合物明确或者隐含记载在在先申请中为原则，否则将会导致权利与义务的失衡。鉴于修改后的权利要求1所保护的化合物和马昔腾坦未记载在在先申请中，故不能享有在先申请的优先权。

（2）关于表格化合物是否充分公开

专利法第26条第3款规定，说明书应当对发明或者实用新型作出清楚、完整的说明，以所属技术领域的技术人员能够实现为准。专利法第26条第4款规定，权利要求书应当以说明书为依据，说明要求专利保护的范围。

“能够实现”，是指本领域技术人员基于说明书的内容，能够实现发明的技术方案，解决其技术问题并产生预期的技术效果。对于化合物发明，说明书应当说明化合物的化学名称、结构式，与发明要解决的技术问题相关的化学、物理性能参数，对化学结构的说明应当明确到使本领域技术人员能够确认化合物的程度；同时还应当记载至少一种制备方法，并完整地公开该化合物的用途和/或使用效果。对于以表格方式列举的具体化合物，如果本领域技术人员基于说明书公开的内容，能够确认该具体化合物的结构，知晓其如何制备得到，并能够预期到其用途和/或技术效果，则说明书对该具体化合物的公开符合专利法第26条第3款的规定。

本案中，修改后的权利要求1涉及两个具体化合物，化合物和马昔腾坦。对于化合物，说明书中给出了其质谱数据和针对ETA和ETB的IC50值，未记载其具体的制备方法；对于马昔腾坦，说明书中仅记载了化合物的结构。

合议组认为，双方关于本专利是否充分公开的争论焦点集中在：（1）针对化合物，说明书未公开其具体的制备方法是否导致本领域技术人员无法制备得到该化合物，以及化合物的技术效果能否得到确认；（2）针对马昔腾坦，在说明书仅公开其化学结构式的情况下，基于说明书公开的内容，本领域技术人员能否确认其结构、制备得到该化合物以及能否确认该化合物的技术效果。

合议组分析后认为，本领域技术人员根据本专利公开的整体内容，结合其常识，能够确认化合物和马昔腾坦的结构并制备得到该化合物，并能够预期化合物和马昔腾担的技术效果。因此权利要求所涉及的化合物满足充分公开的条件。

同时，合议组也强调：虽然从鼓励发明创造的宗旨出发，允许在具体实施方式的基础上，结合本领域技术人员的常识和现有技术的状况，对技术方案进行适当的概括，但是当保护具体化合物时，原则上还应当将其以制备实施例或者效果实施例的方式体现在说明书中，以明确其在申请日前已经完成，仅以表格方式列举具体化合物的方式是不推荐的，也存在因超出本领域技术人员的预期而被认为公开不充分的风险。

（3）关于具体化合物创造性的判断

专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型有实质性特点和进步。如果本领域技术人员在现有技术的基础上，没有动机引入区别特征对最接近的现有技术化合物进行结构改造，得到权利要求的化合物，则该权利要求的化合物具备创造性。

请求人以公开的化合物7k（见图3）为最接近的现有技术，结合其他公开资料和/或本领域关于电子等排的常识，评价化合物和“马昔腾坦”不具备创造性。

合议组认为：化合物、马昔腾坦与化合物7k相比，二者的区别首先在于嘧啶环-4位磺酰胺部分不同：、马昔腾坦为氮连磺酰胺基，而7k为碳连磺酰胺基（见图4）。而它们对于内皮素拮抗的效果基本相当。因此，本发明实际解决的技术问题是提供一种不同的对于ETA和ETB受体均有拮抗作用的化合物。

由于现有技术对于这类化合物的构效关系已经进行了深入研究，认为嘧啶环的4-位磺酰胺部分的变化与ETA、ETB受体的活性有密切关系，且针对4-位进行的诸多取代基变化均指向在保留碳连磺酰胺基的前提下变化其他部分，在此情况下，仅基于生物电子等排理论并不足以认为本领域技术人员有动机将化合物5k中的碳连磺酰胺基替换为氮连磺酰胺基。因此，化合物和马昔腾坦具备创造性。

4、总结

本案在以下几个方面对于化学医药领域发明专利审查具有示范作用。一是本案从分析优先权制度的目的出发，对于在先申请为马库什化合物、在后申请为其范围内的具体化合物时，在后申请可否享有在先申请的优先权明确提出认定规则。二是本案从化合物的确认、制备和用途效果三个维度，抽丝剥茧，阐明表格化合物充分公开的判断规则。三是本案围绕区别特征的引入是否显而易见展开深入分析，既肯定了提供不同的解决方案可以获得专利保护，又避免了机械地以“生物电子等排理论”反推专利技术方案的“后见之明”。

注：封面图片来源于网络