随着科学的进步和对病原物-寄主互作过程研究的深入，科学家发现植物病原物（如细菌，卵菌，线虫和蚜虫等）可以分泌一系列被称为效应蛋白的物质进入寄主从而调控寄主的免疫。相对的，植物也进化出了抗病基因，可以识别部分效应因子，从而引起强烈的免疫反应（ETI，Effector-triggeredimmunity），最终抑制病原菌的繁殖。成功的病原物又会进化出新的效应因子抑制植物的ETI，寄主与病原物就在这样永恒的“军备竞赛”中持续的共进化着。
NRCs（NLRrequiredforcelldeath）是抗病基因的一种，是抗病基因网络的节点基因，可以提供对多种病原物的抗性，并在茄科植物中大量存在。由于NRC网络的广泛性，作者推测病原物也进化出了相应的效应因子抑制NRCs的功能。但是，目前这样的效应因子还未被鉴定，以及其抑制NRC介导的免疫的机制还不清楚。
近日，塞恩斯伯里实验室SophienKamoun课题组在PLOSBiology上发表题为PlantpathogensconvergentlyevolvedtocounteractredundantnodesofanNLRimmunereceptornetwork的学术论文，本文鉴定了抑制NRC功能的效应因子，从进化角度举证了寄主-病原物共进化的例子。
（1）筛选抑制NRC功能的效应因子
为了筛选抑制NRC的效应因子，作者克隆了来自6个不同病原物的效应因子。并与NRC自激活突变体NRC2HR，NRC3DV和NRC4DV在本氏烟叶片中共表达，希望能够筛选到抑制NRC自激活突变体诱导的细胞死亡的效应因子。结果表明，致病疫霉效应因子AVRcap1b和南方根结线虫效应因子SS15不能抑制NRC4DV引起的细胞死亡，但可以抑制NRC2HR和NRC3DV引起的细胞死亡（图一）。
图一AVRcap1b与SS15抑制NRC2HR和NRC3DV引起的细胞死亡
（2）酵母双杂交筛库鉴定NRC2和NRC3是SS15的互作蛋白
既然SS15抑制了NRC2和NRC3的功能，那么这个效应因子应该靶标了NRC2和NRC3功能相关的蛋白。为了鉴定这些蛋白，作者以SS15为诱饵，进行了酵母双杂交筛库实验。注意，由于抗病基因往往长度很长，并且序列复杂，导致免疫沉淀-质谱联用法（IP-MS）很难鉴定到抗病基因。而酵母双杂交筛库时，长蛋白会被打成一个个小片段，这些小片段与诱饵之间的互作很大可能也说明了全长蛋白与诱饵的互作。同时，一些长蛋白仅仅在激活或构想改变的状态下，一些蛋白区域暴露以后，才与诱饵互作。在这种情况下，由于酵母筛库可以筛选互作蛋白的小片段所以更加适用。因为作者的研究目标是长的抗病基因，所以本文使用了酵母双杂交筛库系统。作者成功了筛选到了NRC2和NRC3都是SS15的互作蛋白，并通过截短突变验证了是NRC2和NRC3的NBD区域与SS15互作（图二）。同时，SS15与激活型的NRC2和NRC3都互作（图三）。
图二SS15与NRC2和NRC3互作
图三SS15与激活型NRC2和NRC3互作
（3）酵母双杂交筛库表明AVRcap1b与NbTOL9a互作
作者同样以AVRcap1b为诱饵进行了酵母双杂交筛库，结果表明有13个蛋白互作（图四）。为了进一步缩小范围，作者进行了IP-MS实验，鉴定到了8个与筛库结果有重叠的蛋白。其中三个是TOL家族蛋白。作者进一步挑选NbTOL9a进行验证，通过Co-IP实验，作者进一步证明了AVRcap1b与NbTOL9a的互作（图四）。
图三SS15与激活型NRC2和NRC3互作
图四AVRcap1b与NbTOL9a互作
（4）同时回补番茄INP1与INP2可以回补拟南芥inp1突变体的表型
NbTOL9a在植物ETI中的功能还不清楚，为了探索NbTOL9a是否参与NRC相关的功能。作者利用RNAi技术对NbTOL9a进行了沉默，并检测了NRC2和NRC3自激活突变体的细胞死亡表型。结果表明，在沉默NbTOL9a之后，NRC2和NRC3自激活突变体的细胞死亡表型明显增强，说明NbTOL9a负调控NRC2和NRC3的功能（图五）。
图三SS15与激活型NRC2和NRC3互作
图五NbTOL9a负调控NRC2和NRC3的功能
总结
本文以病原物-寄主共进化为切入点，提出了病原物可能分泌效应因子抑制抗病基因网络的假说。通过对效应因子的筛选，发现确实有效应因子抑制NRC的功能。进一步通过巧妙地应用酵母双杂交筛库技术，发现了线虫效应因子可以与NRCs互作。而另一个致病疫霉效应因子则与NRC的负调控因子NbTOL9a互作。本文从进化角度举例论证了病原物-寄主共进化的存在，并进一步发现了一个新的NRC功能的负调控因子NbTOL9a。同时，从技术上，本文是合理利用不同鉴定互作蛋白技术的典范研究。
参考文献
1.WinJ,Chaparro-GarciaA,BelhajK,SaundersDG,YoshidaK,DongS,etal.Effectorbiologyofplantassociatedorganisms:conceptsandperspectives.ColdSpringHarbSympQuantBiol.;77:–47.
